شانكر عمقی پوست گردو

بیماری ناشی از باكتری Erwinia rubrifaciens كه نشانه‌های آن تشكیل رگه‌های قهوه‌ای درناحیه‌ی آوندهای آبكشی و لایه‌ی زاینده و خارج شدن صمغ سیاه رنگ از تنه‌ی گردوست.



بررسی بیماری شانکر پوستی ( باکتریایی ) درختان گردو در استان همدان

چکیده :

بیماری شانکر پوستی (شانکرباکتریایی) گردو یکی از مهمترین بیماری‌های خسارت‌زا بوده و در شرایط محیطی مناسب (دما و رطوبت بالا) به عنوان یک عامل جدی، درختان گردو را تهدید می‌نماید.دراین بررسی درطی سالهای 82-1380 از اوایل بهار با برنامه ریزی به طور هفتگی باغات گردوکاری مورد بررسی وبازدید قرارگرفت. از پنج منطقه گردوکاری استان شامل تویسرکان، همدان ،ملایر ، بهار و اسدآباد، تعداد 128 باغ مورد نمونه‌برداری قرارگرفت. با انتقال نمونه‌های مشکوک از پوست و چوب با ترشح شیرابه به آزمایشگاه، جداسازی بر روی محیط‌های YDC، EMB، NA صورت گرفت. استرینهای باکتری بدست آمده بر اساس تعدادی از خصوصیات مرفولوژیکی، بیماری‌زایی، فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی مورد مطالعه و ارزیابی قرارگرفتند. با انتخاب پنج ایزوله، اثبات بیماری‌زایی بر روی شاخه‌های یکساله درختان و تنه نهال‌های بذری دوساله انجام گرفت.علائم بیماری پس از 14-12 روز در چهار ایزوله به صورت ایجاد کلروز و متورم شدن پوست در محل تزریق بودکه پس از فشاردادن تورم‌ها، شیرابه قهوه‌ای رنگی از آنها خارج گردید. باکتریها ، میله ای شکل، در انتها کمی خمیده وگرد بوده و معمولاً به صورت منفرد یا در زنجیرهای کوتاه مشاهده می‌شوند. هر سلول باکتری، متحرک، دارای چند تاژک محیطی و قادر به تولید اندوسپور یا کپسول نیستند. روی محیطEMB سبز متالیک و روی YDC پس از حدود 24 ساعت رشد به رنگ سفید و کروی میشوند. باکتری‌ها گرم منفی، اکسیداز منفی، کاتالاز مثبت و بی هوازی اختیاری (مثبت O/F) هستند.استرین‌های باکتری، دارای توانایی تولید سولفید هیدروژن از سیستئین، اوره‌آز وفسفاتاز مثبت، قادر به رشد در دمای 36 درجه سانتیگراد و تحمل نمک طعام 3% ولی در دمای 39 درجه سانتیگراد و محیط حاوی 5% نمک طعام قادر به رشد نبودند. بر اساس خصوصیات مذکور باکتری عاملBrenneria (Erwinia) nigrifluens  شناسایی گردید.

دربررسی‌های مزرعه‌ای، ازمحل‌های نمونه‌برداری دو نوع شانکر مشاهده گردیدکه شامل شانکر پوستی سطحی و شانکر عمیق زیر پوستی و پاتوژن باکتریایی در هردومورد درجنسBrenneria  قرار گرفتند.درخصوص پراکنش بیماری، نتایج نشان دادکه منطقه تویسرکان با 35 درصد آلودگی و در رتبه‌های بعدی منطقه همدان (22%) و اسدآباد (25%) به ترتیب آلوده‌ترین مناطق استان ‌می‌باشند. حدود 25درصد از باغات مورد مطالعه و در هر باغ به طور متوسط یک اصله درخت مشکوک و دارای بیماری شانکر پوستی ‌می‌باشدکه با ایجاد زخم و شکاف، راه نفوذ سایر آفات و عوامل بیماری‌زا را تسهیل کرده و باکاهش بنیه و کمیت محصول، بتدریج باعث زوال و مرگ و میر درختان ‌می‌گردد.

واژه‌های کلیدی:گردو، شانکرپوستی، همدان

 

 

مقدمه:

گردو از درختان بسیار ارزشمندی است که اهمیت چوب، میوه، صنعتی، ارزآوری و سایر خصوصیات مفید آن بر همگان روشن بوده و می‌تواند نقش مهمی را در اقتصادکشور ایفا کند.

گردو با نام انگلیسی «Walnut»، عربی «جوز»  و فرانسوی«Niox»  میوه درختی است از میوه‌های آجیلی (مغزدار) از خانواده Juglandaceae که نام علمی آن (نام جنس) juglans‌می‌باشد. این جنس دارای 21 گونه بوده و شش گونه از این جنس در نقاط مختلف گردو خیز دنیا، از لحاظ میوه و پایه مهمتر بوده و مورد استفاده و توجه قرار گرفته‌اند که شا مل:

J.cinerea L.  و J.major L.  و J.sieboldiana L.  و J.hindsii L.  و J.nigra L.  و Juglans  regia L. (1).

گونه J.regia به نام گردوی ایرانی یا گردوی فارسی به دلیل ویژگی‌های کم نظیر وخصوصیات خوب و چند منظوره آن بسیار مورد توجه بوده و از نظر ارزش صنعتی، تجاری، دارویی و تطابق و سازش با انواع خاک‌ها مهمترین گونه جنس ژوگلانس می‌باشد (1).

لازم به ذکر است که J.regia برخلاف J.nigra (گردوی سیاه) نسبت به اغلب بیماری‌های ریشه حساس بوده ولی به دلایل بالا و ضمناً وحشی بودن نسبی و ویژگی‌های خوب و طبیعی که دارد، بهترین پایه انتخابی برای پیوند (مخصوصاً داشتن مقاومت در برابر ویروس «CLRV» عامل خط سیاه گردو) و کاشت در اغلب مناطق گردو خیز ایران شناخته شده است (1).

J.regia   بین رشد گیاهی و جنسی درخت تعادل برقرار کرده و به‌طور کم و بیش محصول مرغوب‌تر و بیشتر از سایر گونه‌ها تولید می‌نماید.

وضعیت درختان گردو موجود در ایران و جهان:

کشورایران سرزمینی است حاصلخیز با اکوسیستمی متنوع و وسیع که قسمتی از رویشگاه‌های وسیع گردو را در دنیا شامل می‌شود که این تنوع اقلیم و اکوسیستم را درسایر نقاط جهان کمتر می‌توان یافت.

منشـأ طبیعی گردوی ایرانی، مناطق کوهستانی آسیای مرکزی است. گرچه بسیاری از دانشمندان، فلات ایران را منشأ اصلی J.regia دانسته ولی تحقیقات مولکولی و ایزو آنزیمی ثابت نموده که مرکز تنوع گردوی معمولی، دامنه‌های شمالی رشته کوه تین شان (Tien Shan) واقع دراستان زین جیانگ درشمال‌غربی کشور چین می‌باشد (2).ازآنجا که درگذشته‌های بسیاردور، گردو از فلات ایران به یونان و روم و بعداً به انگلستان برده شده و درسال 1769 میلادی توسط انگلیسی‌ها به آمریکارفته، برخی از باغ‌داران به اشتباه، این گونه را گردوی انگلیسی (English Walnut) می‌نامند. برخی از ارقام گردو مربوط به گونه J.regia  از مناطق کوهستانی واقع درکارپاتین لهستان منشأ گرفته‌اند که به «گردوی کارپاتی» معروفند (2).عده‌ای از محققین عقیده دارند که این واریته‌ها می‌توانند دمای منفی 35 درجه سانتیگراد را تحمل کرده و زنده بمانند و به عنوان نژاد‌های مقاوم گردو به سرما شناخته شده‌اند.

درختان گردو در عرض جغرافیایی 39-29 درجه شمالی و طول جغرافیایی 46-45 درجه شرقی، از زمین‌های کم ارتفاع تا مناطقی با ارتفاع 2500 متر از سطح دریا (درقریه «هنزا» در شمال ساردوئیه جیرفت) به صورت اهلی یا وحشی وجود داشته و مورد استفاده قرار می‌گیرند (2).

باغ‌های گردوی کشور به میزان وسیعی دردامنه‌های رشته کوه‌های البرز، زاگرس، لاله زار و جبال بارز یافت می‌شوند. همچنین تویسرکان، تفرش، خوانسار و بافت کرمان از مراکز عمده گردوکاری کشور می‌باشند.اکثر قریب به اتفاق این‌ درختان حاصل کشت بذر بوده و به همین دلیل دارای تنوع صفات و تفرق زیادی هستند.

میزان کل سطح زیر کشت گردو بارور در دنیا در سال 2001میلادی563000 هکتار بوده و میزان تولید کل گردوی جهان در سال 2001میلادی 382/221/1 تن بوده که به ترتیب کشورهای چین با 000/330 تن، آمریکا با 000/225 تن، ایران با 000/135 تن و ترکیه با 000/122 تن از مهمترین کشورهای تولید کننده گردو در جهان بوده اند ( آمار سازمان خواروبار و کشاورزی جهانی ( فائو 2001) . درسال 2001 میلادی از لحاظ سطح زیر کشت درختان بارور گردو، به ترتیب چین با 000/175 هکتار و در رتبه دوم کشور آمریکا با 000/70 هکتار و در رتبه سوم ایران با 000/48 هکتار قراردارند (آمار فائو 2001).

استان همدان طبق آمار نامه رسمی سال 1382 وزارت جهاد کشاورزی با دارا بودن حدود 8800 هکتار گردوکاری و تولید نزدیک به 000/20 تن میوه، از لحاظ سطح زیرکشت بعد ازاستان کرمان، مقام دوم و ازنظر میزان عملکرد محصول در هکتار،  مقام اول کشور راداراست (2).

یکی از مهمترین عوامل کاهش تولید و کمیت و کیفیت محصول، بیماری‌های این گیاه بوده بخصوص، بیماری شانکر باکتریایی که در سال‌های اخیر یک روند افزایشی پیداکرده و درشرایط محیطی مناسب، با افزایش زوال و مرگ و  میر تدریجی درختان گردو، یک تهدید جدی برای این محصول محسوب می‌شود.با بررسی‌های لازم و  شناسایی عوامل بیماری‌زای مزبور، می‌توان در اتخاذ تصمیمات کنترلی صحیح و اصولی، بر پایه و در چهارچوب IPM  گردو اقدام نمود.

کلاً دراثر عدم شناخت یا شناخت غلط از عوامل بیماری‌زا است که باعث سمپاشی‌های بی‌رویه، آلودگی محیط زیست و هدر رفتن نیرو و سرمایه را به دنبال داشته، همچنین باعث اشتباه در حذف کانون‌های آلودگی می‌گردد.درنهایت می‌توان گفت که شناخت دقیق از عوامل بیماری‌زا موجب جلوگیری از اپیدمی‌هاو هدر رفتن سرمایه‌های هنگفت می‌گردد.

درخت گردو مورد حمله تعدادی از باکتری‌های بیماری‌زای گیاهی قرار می‌گیرد، از جمله:

1- عامل تو مور (گال) باکتریایی

   Comm. ( Smith & Townsend 1907 )  Agrobacterium  tumefaciens

2- عامل بلایت باکتریایی وپوسیدگی مغز گردو

Xanthomonas   arboricola  pv.juglandis (Pierce 1901) Vauterin eta1., 95) 

3-  باکتری عامل گوموز (شیره ترش) وبلاست گل‌

Psuedomonas syringae pv. syringae Van Hall 1902.

باکتری مولد شانکر پوستی گردو که بر دو نوعند: 1- شانکر پوستی سطحی(Shallow bark canker) با عامل

Brenneria (Erwinia) nigrifluens   Wilson,Starr&Berger  1957.

2- شانکر عمیق زیر پوستی   (Deep  bark  canker )

Brenneria (Erwinia)  rubrifaciens Wilson,Zeitoun&Fredriclson 1967    تاریخچه بیماری:

 

بیماری شانکر پوستی گردو اولین بار درسال 1955 میلادی در منطقه کالیفرنیای آمریکا مشاهده شد و پس ازآن در برخی نواحی دیگر ازقبیلYolo,colusu, Sutter,   گزارش گردید (50).کلیه این نواحی در منطقه ساکرامنتو (Sacramento) در شمال کالیفرنیا قرار داشته و از بقیه مناطق کالیفرنیا و سایرایالت‌ها گزارش نشده بود.

عامل بیماری برای اولین بار توسط ویلسون و همکاران، گونه‌ای از جنس اروینیا (برینریا) بنام : Erwinia    nigrifluens  Wilson etal., 1957  شناسایی و نام‌گذاری گردید.

این بیماری در تمام ارقام گردو از جمله:Mylan, Payne, Eurek, Mayatte, Pedro, Lara, Franguet, Mammoth, Myrtleford  ایجاد بیماری می‌کند (50).رقم خیلی حساس به این بیماری در آمریکا رقم Hartley  بوده و عمده خسارت روی این رقم دیده می‌شود. علائم بیماری همچنین روی رقم گردو آمریکایی (J.hindsii) و رقم هیبرید (J.hindsii-J.regia) دیده شده است.

بررسی‌های انجام شده درآمریکا نشان می‌دهد که بیماری شانکر گردو در آن سال بر روی 9 رقم گردو ایرانی، یک رقم هیبرید و یک رقم بومی آمریکا وجود دارد.

باکتری عامل شانکر پوستی عمیق گردو توسط کادو وگاردن (Kado and Garden, 1973) بنام Erwinia  rubrifaciens  شناسایی و گزارش گردید.طبق بررسی‌های نامبردگان، حساسیت میزبان، نسبت به عامل بیماری (E.rubrifaciens) به زمان آلودگی، وجود زخم و میزان اینوکولوم اولیه بستگی دارد. ضمناً علائم گسترده و سیستمیک و خسارت بالای این بیماری را در واریته‌های گردوی ایرانی از جمله‌هارتلی، مشاهده نموده‌اند.

گاردنر و کادو (Gardner and kado, 1973) در تحقیقات خود با آلوده کردن درختان گردو رقم‌هارتلی به موتان‌های مقاوم شده E.rubrifaciens  به آنتی بیوتیک‌های ریفا مپیسین و نئومایسین در زمان‌های مختلف سال و سپس بعد از چند ماه، باکتری‌ها را حداکثر 300 سانتیمتر دور از محل آلودگی، جداسازی کرده و حرکت سیستمیک این باکتری را در گردوهای ایرانی، ثابت کردند.

شاد و همکاران (Shaad et al., 1973) در بررسی خود با عنوان «تأ ثیرغلظت اینوکولوم، مدت زمان بعد از ایجاد زخم و فصل بر روی آلودگی درختان گردوی ایرانی به E.rubrifaciens  ،گزارش نمودند که رقم هارتلی، موقعی که درماه‌های آوریل، ژولای و اکتبر به طور مصنوعی زخمی می‌شود نسبت به پاتوژن مذکور کاملاً حساس بوده ولی در ژانویه خیر (ماه‌های سرد سال) .

در ماه ژانویه، هیچگونه آلودگی حتی با غلظت cfu/ml  10از باکتری بوجود نمی‌آید، در صورتی که 10-5 سلول باکتری در هرزخم در زمان اکتبر کافی است تا آلودگی را شروع کند. ماه اکتبر بویژه با زمان برداشت مکانیکی محصول توسط شیکر ارتباط دارد.زخم‌های ایجاد شده جهت نفوذ باکتری با زمان ارتباط منفی داشته و هرچه از زمان تشکیل آنها می‌گذرد، میزان حساسیت درخت گردو، کاهش می‌یابد.

کادو وگاردنر (Kado and Gardner,1977) با انجام آزمایشات خود مشاهده نمودند که برداشت مکانیکی میوه گردو با دستگاه شیکر، باعث انتقال و سرایت آلودگی درختان بهE.rubrifaciens می‌شود. این دستگاه زخم‌هایی بر روی تنه و شاخه‌ها ایجاد کرده و با آزمایشات خود ثابت کردند که یک سال پس از آلودگی توسط این باکتری، به میزان 350-80 سانتی‌متر، باکتری ازمحل زخم پیشروی داشته است.

مورون و همکاران (Morone et al.,1998) اولین گزارش از وجود و پراکندگی بیماری شانکر پوستی گردو را با عاملE.nigrifluens در ایتالیا ارائه دادند. نامبردگان با تشریح علائم بیماری و باتست‌های بیماری‌زایی، بیوشیمیایی،  فیزیولوژیکی و تجزیة اسیدهای چرب باکتری، آن را شناسایی نمودند. ضمناً میزان آلودگی درختان را در منطقة مورد نظر، ده درصد (از بین 600 اصله درخت گردو) برآورد نمودند.

تیویتدال و همکاران (Teviotdale et al., 1991) درکالیفرنیا باآزمایشات خود، انتقال باکتری عامل شانکر عمیق زیر پوستی گردو را توسط پیوند جوانه چوب، ثابت و گزارش نمودند. این افراد ابتدا علائم بیماری شانکر پوستی را بر روی 181 اصله درخت رقم هارتلی از بین 1640 اصله درخت کاشته شده در یک باغ، در اولین تابستان سال کشت مشاهده نموده و بعد از چند سال با انتخاب جوانة چوب از درختان آلوده و انجام پیوند بر روی پایه‌های J.hindsii  و بررسی‌های بعدی همانطور که ذکر گردید، انتقال بیماری را ثابت کردند.

لوپز و همکاران (Lopez et al.,1994) با جداسازی باکتریE.nigrifluens از درختان گردوی بومی، با تشریح علائم بیماری، انجام تست‌های بیماری‌زایی، بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی، آن را شناسایی کرده و به عنوان اولین گزارش از وجود شانکر پوستی سطحی در اروپا  ارائه نمودند.

ساکاردی و همکاران (Saccardi et al.,1998) وقوع بیماری شانکر پوستی گردوی ایرانی را بر روی درختان 20-15 ساله و درختان موجود در نهالستان، در شمال ایتالیا گزارش نمودند. ساکاردی و همکاران باتوصیف علائم بیماری، انجام آزمون‌های بیماری‌زایی و ذکر خصوصیات فنوتیپی باکتری، عامل بیماری راE.nigrifluens  گزارش نمودند (بر روی درختان 20-15 ساله و درختان جوان گردو در نهالستان) .نامبردگان اضافه نمودند که در طول سال‌های 1997-1995 م. در منطقة مذکور (ونتو) بر روی درختان 20-15ساله و نهال‌ها، شانکرهایی بر روی تنه و شاخه‌های اصلی مشاهده گردید که شامل نواحی قهوه‌ای و با ترشح شیرابه همراه بوده و علائم بر روی نهال‌ها به صورت ایجاد شیارهای طولی که باقهوه‌ای رنگ شدن و تغیر شکل شدیدتنة نهال‌ها توأم بوده است. علائم بیماری را بر روی درختان جوان غیرمعمول ذکرکردند که اولین گزارش از وقوع بیماری در ایتالیا می‌باشد.

اسکار تیچینی و همکاران (Scortichini et al.,1999)، وقوع خسارت‌بار بیماری شانکر پوستی گردو در نواحی مرکزی ایتالیا را گزارش نموده و ضمناً پس از انجام تست‌های بیماری‌زایی، بیوشیمیایی و الکتروفورز پروتئین‌های سلولی، باکتری عامل را برای سومین بارازایتالیا، E.nigrifluens گزارش کردند.

گنزالس و همکاران (‌Gonzalez et al.,2002) بیماری شانکر پوستی بر روی رقم هارتلی از گردوی ایرانی را مشاهده کرده و مورد بررسی‌های مزرعه‌ای و آزمایشگاهی قراردادند.نامبردگان، ضمن تشریح علائم بیماری از ‌جمله ترشح شیرابة تیره رنگ ازشانکرهای روی تنه و شاخه‌ها در تابستان، در نهایت عامل بیماری را Brenneria (Erwinia)  nigrifluensگزارش دادند.

منارد و همکاران (Menard et al.,2004) از روی ارقام مختلف گردو ازگونه J.regiaدر فرانسه، بیماری شانکر پوستی را  با خسارت شدید مشاهده نمودند. نامبردگان با بررسی 13 باغ بزرگ و نهالستان گردو در جنوب غربی، جنوب‌شرقی و غرب فرانسه، شانکرهای عمودی باترشح شیرابه بر روی تنه و شاخه‌های درخت را رؤیت کردند. سپس با انتقال نمونه‌های بیماری به آزمایشگاه و براساس خصوصیات بیماری‌زایی، فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی استرین‌های باکتری، برای اولین بار از فرانسه باکتریBrenneria (Erwinia) nigrifluens  را گزارش نمودند.

کادو و همکاران (Kado et al.,1977) با ارزیابی میزان حساسیت ارقام مختلف گردو به باکتری E.rubrifaciens (عامل شانکر عمیق زیرپوستی) بر روی 54  رقم ازگونه‌های J.regia , J.nigra, و J.hindsii که برروی پایه‌های J.hindsii  و ریزوم‌های پارادوکس پیوندشده بودند، در نهایت رقم‌ها را در چهار گروه حساس قرار دادند.

فِیستنر و همکاران (Feistner et al.,1982) با استخراج rubrifacine  ازE.rubrifaciens  سوا شده از درختان گردو، نحوة استخراج، مشخصات این رنگدانه و مکانیسم عمل (جلوگیری از انتقال الکترون درمیتوکندریها) رابررسی و توصیف نمودند.

طبق گزارش میرستیخ و همکاران (Mircetich et al.,1987) شانکر باکتریایی گردو  بر دو نوع است:

1-شانکرپوستی سطحی (Shallow  bark  canker)

در این بیماری به دلیل بوجود آمدن نواحی نکروزه شده به صورت نقاط کوچک کروی در ناحیة کورتکس و دقیقاً در زیر خارجی‌ترین لایة پوست به نام  لایة چوب‌پنبه یا Pheloderm تشکیل شده و در اثر گسترش، علائم شانکر بدون شکل مشخص در نواحی پوست بوجود می‌آید.

معمولاً در مراحل اولیة بیماری، علائم ازخارج قابل مشاهده نیست و پوست حالت متورم و بر‌آمده پیداکرده و علائم بیماری در اکثر موارد محدود به ناحیة پوست می‌باشد. در حالت طبیعی و شرایط مزرعه‌ای، آلودگی برگ، شاخه‌های جوان، جوانه‌ها و میوه دیده نشده است و حتی با تزریق باکتری نیز علائم بیماری بر روی اندام‌های مذکور ایجاد نشده است. گسترش بیماری کند و خسارت آن نیز اندک گزارش شده است.

2- شانکرپوستی عمیق یاشانکرزیرپوستی گردو (Deep bark canker)

با ایجاد شانکرهایی که طول آنها به چند تا چندین سانتیمتر رسیده و همراه با ترشح شیرابة قهوه‌ای تا سیاه رنگی است. شانکرها ابتدا سطحی و بتدریج عمیق می‌شوند. در موارد بسیاری این نوع شانکرها باعث مرگ درختان نمی‌شوند ولی نفوذ سایر آفات و عوامل بیماری‌زا را تسهیل می‌کند. درختان آلوده دارای ضعف عمومی، تنک شدن درخت، پژمردگی شاخه و برگ، خشکیدگی سرشاخه‌ها بوده که عامل این بیماری باکتری E.rubrifaciens  گزارش شده است.علائم بیماری عمدتاً روی درختان میانسال و مسن (20-10 ساله) گزارش شده است (درشانکرباکتریایی) و حتی در روی درخت گردو نیز، علائم مربوطه اغلب و معمولاً روی مسن‌ترین قسمت درخت که تنه است بوجود می‌آید و این نحوة ایجاد علائم و ماهیت بیماری در موردبسیاری دیگر از بیماری‌ها دیده نشده است.

وضعیت بیماری درایران:

بیماری شانکرپوستی گردو اولین بار در سال 1365 در نقاط محدودی از استان مازندران (زاغمرز و نکاح) توسط رحیمیان مشاهده و مورد بررسی قرارگرفت. رحیمیان (1365) با انجام تست‌های بیماری‌زایی و بر اساس خصوصیات فنوتیپی، باکتری عامل بیماری را E.nigrifluens شناسایی وگزارش نمود.

در آن سال (1365) اطلاعی در مورد وجود این بیماری در سایر مناطق استان مازندران و مناطق همجوار وجود نداشت. حسن زاده (1370)، باکتری E.nigrifluens را از گیاه آفتابگردان در مناطقی از استان مرکزی، جداسازی، شناسایی وگزارش نمود.

حریقی و رحیمیان (Harighi and Rahimian,1997) وجودگسترده و فراوان باکتری عامل شانکر پوستی گردو (E.nigrifluens) را بر اساس انجام تست‌های فیزیولوژیکی، بیوشیمیایی، بیماری‌زایی و بررسی‌های اکولوژیکی در استان مازندران ارائه دادند.

برادران و قاسمی (1383) با بررسی اتیولوژی شانکرگردو، ضمن توصیف علائم بیماری با انجام تست‌های بیماری‌زایی، فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی، عامل بیماری را  E.nigrifluensشناسایی کرده و به عنوان اولین مورد از باکتری فوق در استان کرمان، گزارش نمودند.

یوسفی کوپایی، تقوی و بنی هاشمی (1383) در تحقیق خود با عنوان «پراکنش و سبب‌شناسی بیماری شانکر پوستی گردو در استان‌های فارس، کهکیلویه و بویراحمد» با نمونه‌برداری از درختان آلوده، 61 جدایه باکتری را از نظر خصوصیات فنوتیپی، حساسیت به آنتی بیوتیک‌ها، الکتروفورز پروتئین سلولی و سرولوژی مورد بررسی و مقایسه قراردادند.در نهایت با انجام آزمون‌های فوق (من‌جمله آزمون‌های بیماری‌زایی)، پاتوژن عامل بیماری را Brenneria  nigrifluens شناسایی نمودند. نامبردگان تنوع بسیار کم خصوصیات فنوتیپی بین جدایه‌ها و شباهت زیاد نقوش الکتروفورزی در باکتری‌ها را بیانگرتنوع‌پذیری محدود این گونه دانسته و ضمن بیان گستردگی وسیع بیماری شانکر پوستی گردو در دو استان مورد برسی خود، ا ولین گزارش از وجود بیماری مذکور را در فارس و کهکیلویه و بویر احمد ارائه کردند.

حسن زاده (Hassanzadeh,1996) باکتری E.nigrifluens رابه عنوان عامل شانکر پوستی گردو، پس از انجام تست‌های بیماری‌زایی و بیوشیمیایی از ایران گزارش کرد.

وضعیت تاکسونومیکی باکتری‌های  :Enterobacteriaceae

لیزیان و همکاران (Lysiane et al.,1998) بر اساس ترادف 16SrDNA، 29 استرین گونه‌های همراه گیاه از جنس‌هایPantoea , Erwinia, Enterobacter و مقایسة آنها با دیگر اعضاء Enterobacteriaceae ، وضعیت و موقعیت جدید فیلوژنی این خانواده راتعیین کردند.

گونه‌های جنس Erwinia ممکن است به سه گروه فیلوژنی تقسیم شوند.گروه I اروینیاهای حقیقی که گونه‌هایE.amylovora، E.mallotivora،  E.tracheiphila، E.pesidil، E.rhaponticiوE.persicinus را در بر می‌گیرد.

محققین مذکور پیشنهاد دادندکه گروه II شامل: E.carotovora   sub sp. atroseptica، E.chrysanthemi، E.carotovora subsp. wasabiae، E.carotovora ، E.carotovora subsp. odorifera،E.cypripedii ،E.cacticida  sub sp.E.carotovora  subsp. carotovora  و E.carotovora subsp. betavas culorum وE.cypripedii

درجنس  Pectobacteriumباشند و ترتیب نام‌گذاری زیراعمال شود:

P.carotovorum  sub sp .  odoriferum comb.nov

P.carotovorum  sub sp .  carotovorum comb.nov

P.chrysanthemi,  P.cacticidum  comb.nov,

P.carotovorum  sub sp.  wasabiae  comb.nov

P.cypripedii

گونه‌های:                       E.quercina,  E.alni,    E.rubrifaciens,  E.nigriflues

و E.salicis وE.paradisiaca درگروه  III قرارداشته وجدیداً در یک جنس جدید به نام  Brenneria قرارمی‌گیرندبه ترتیب شامل:

B.paradisiaca  comb.nov , B.nigrifluens  comb.nov,  B.rubrifaciens , B.quercina comb.nov , B.salicis comb.nov B.alni comb.nov هستند.

گونه‌های جنس Pantoea تشکیل یک شاخة منوفیلتیک را می‌دهند (گروهIV) .گونه‌های جنسPantoea با Erwinia قرابت نزدیک دارد، هر چندکه سه گونة فیتوپاتوژنیک جنس Enterobacter در بین جنس‌های  CitrobacterوKlebsiella قراردارد.

موقعیت تاکسونومیکی جنس Erwinia:

جایگاه تاکسونومیکی جنس اروینیا در ارتباط با سایراعضاءخانوادة Enterobacteriaceae و همچنین موقعیت گونه‌های مختلف این جنس، بر اساس روش‌های مختلفی ازقبیل هیبریداسیون DNA (Hybridization DNA:DNA)، خصوصیات فنوتیپی و آنالیز عددی (Numerical  anylysis) و سرولوژی (Serological method) مورد بررسی قرار گرفته است.

جنسErwinia  اولین بارتوسط وینسلو (Winslow,1918) با حدود60 گونة مختلف به کاربرده شد. الیوت (Elliot,1930) این گونه‌ها را در جنس Bacillus قرارداد و برای بار اول، ران (Rahn,1937) این جنس ر ادر خارج از خانوادة Enterobacteriaceae طبقه بندی نمود.

والدی (Waldee,1945) و ادواردز و اوینگ (Edwards and Ewing,1962) پیشنهاد دادندکه باکتری‌های متعلق به جنس اروینیا، باید در خارج از خانوادة انتروباکتریاسه طبقه بندی شوند.

برنر و همکاران (Brenner et al.,1972) نشان دادند که میزان تشابه DNA بین گونه‌های E.amylovoraوEscherichiacoliبیشتر از تشابه بین E.coli و بقیة اعضاء خانوادة انتروباکتریاسه است.

گاردنر و کادو (Gardner &Kado,1972) نیز با تحقیقات خود، نتایج مشابهی بدست آوردند. براساس نتایج بررسی نامبردگان، درصد GC در جنس اروینیا از51 الی57% متغیر بود ولی این دامنة تغییرات شبیه به بقیة اعضاء خانواده بود، در صورتی که صرفاً بر اساس درصدGC  قضاوت شود، نمی‌توان بین جنس اروینیا و بقیة اعضاء این خانواده تمایز و فرق گذاشت.

دای (Dye,1968) با بررسی‌های خود، جنسErwinia را به چهارگروه زیرتقسیم بندی کرد:

1- The   amylovora  group

2- The  carotovora  group

3- The  herbicola group

4- Atypical  Erwinia

دای (Dye,1968) بر اساس برخی خصوصیات فنوتیپی، تفاوت‌های گونة E.nigrifluens را با سایر باکتری‌های گروه ازقبیل E.rubrifaciens، E.tracheiphila، E.quercina وE.salicis مشخص نموده، ولی معتقد بودکه تفاوت مهم واساسی بین این گونه وگونة E.amylovora وجود نداشته وبراین مبناآن رابه عنوان واریته ای ازE.amylovora رده بندی نمود.دای ضمناً ذکر نمودکه با وجود اینکه این باکتری و باکتری E.rubrifaciens هر دو عامل ایجاد شانکرگردو هستند ولی فاقدتشابه اساسی بوده به نحوی که بتوان هر دو گونه را هم نام تلقی کرد.مطالعات وتحقیقات بعدی نشان دادکه این دوگونه حدود40% همولوژی DNA دارند. همچنین میزان تشابه DNA باکتری E.nigrifluens باگروه Herbicola حدود15-13% و با گروه amylovora حدود19% می‌باشد در حالیکه میزان شباهت  E.nigrifluensبا گروه carotovora حدود 45-35% می‌باشد. در نهایت نتیجه‌گیری شدکه تقسیم بندی قبلی دای (Dye,1968) که آنرا واریته‌ای ازE.amylovora محسوب کرد، صحیح نیست.

بررسی خصوصیات فنوتیپی و برمبنای آن، آنالیز عددی (Numerical  analysis) داده‌ها، باکتری E.nigrifluens را به عنوان یک گونة کاملاً مجزا از بقیه متمایز می‌نماید.

کادو و آزاد (Kado & Azad,1980) با بررسی خصوصیات فنوتیپی دواسترین باکتری  E.nigrifluens به میزان 91-83% تشابه و همانندی بین این دواسترین بدست آوردند و این گونه را در یک  Subclusterمجزا ولی نزدیک به  E.rubrifaciensوE.quercina قراردادند.ضمناً نامبردگان با مطالعات خود دریافتندکه همولوژی DNA باکتری E.nigrifluens باگونة  E.rubrifaciens حدود37%می‌باشد.

دای ( Dye,1981) با استفاده از چهار روش آنالیز عددی نشان داد که گونة E.nigrifluens یک گونة کاملاً مجزا از بقیة اعضاءگروه amylovora بوده و در پیشنهاد قبلی خود (Dye,1968) که آن را واریته‌ای (Variety) ازE.amylovora  در نظرگرفته بود، تجدید نظرکرد.

مرگارت و همکاران (Mergaert et al,1984) استرین‌ها را با استفاده از سیستم API بررسی کرده و نشان داد که این استرین‌ها همگی در یک Phenon کاملاً جداگانه قرار می‌گیرند و بنابراین اساس داده‌های عددی، این باکتری به صورت یک گونة کاملاً مجزا و مستقل و در عین حال هموژن (Homogen) تلقی شد.

وردانک و همکاران (Verdonch et al,1987) با بررسی‌های خود نتایج مشابهی بدست آوردند و باکتری E.nigrifluens را در یک Phenon جداگانه طبقه بندی کردند.در این گزارش، تفاوت عمدة این Phenon با گروه‌های دیگر، تفاوت در تولید اسید از آرابیتول، اینوزیتول، ملی‌بیوز و رامنوز ذکرگردیده است.

علیرغم اینکه در تمام مطالعات انجام شدة قبل و بر اساس میزان همولوژی DNA گونه‌های E.rubrifaciens، E.nigrifluens، E.salicis به عنوان گونه‌های نزدیک به هم و با درصدتشابه بالا قیدگردیده بودند ولی بر اساس خصوصیات فنوتیپی، این موضوع مورد تأیید قرار نگرفته بود.

خصوصیات باکتری شناسی جنس  Erwinia

این جنس برای اولین بار توسط وینسلو و همکاران (Winslow et al .,1917) نامگذاری گردید. الیوت و دیکی (Elioth & Dickey) خصوصیات زیر را برای باکتری‌های این جنس ارایه دادند:

نسبتاً میله‌ای، 3-1×1ـ5% میکرومتر، معمولاً بصورت منفرد و گاهاً به صورت زنجیره‌های کوتاه، گرم منفی، اکثراً متحرک بوده (motile) و عمدتاً دارای تاژک محیطی (Peritrichus)، بی‌هوازی اختیاری، اکسیداز منفی وکاتالاز مثبت می‌باشد.

درجه حرارت اپتیمم برای رشد30-27 درجةسانتیگراد و ماگزیمم40-32 درجةسانتیگراد. غالباً توانایی تولید اسید از گلوکز، گالاکتوز، فروکتوز، سوکروز و متیل گلوکوزید را دارند. قادربه استفاده از استات، فومارات، مالات، ساکسینات و گلوکانات بوده ولی به عنوان منبع کربن و انرژی نمی‌توانند از اگزالات، بنزوات و پروپیونات استفاده کنند. تولیدگاز از گلوکز در باکتری‌های این جنس بندرت دیده می‌شود. نتیجةآزمون‌های اورنی‌تین، آرجی‌نین، دکربوکسیلازولیزین (به غیر از تعداد معدودی از گونه‌ها در گروهCarotovora) منفی است.

گونه‌های این جنس بصورت پاتوژن گیاهی، ساپروفیت و اپی‌فیت (Epiphyte) وجود دارند و درصد C+G 58-50% می‌باشد.اکثرگونه‌ها در محیط‌های حاوی آمونیاک به عنوان منبع ازت قادر به رشد هستند ولی برخی از گونه‌ها جهت رشد مناسب، احتیاج به فاکتورهای رشد دارند.

گونه‌های مختلف جنس (Erwinia) Brenneria بیماری‌های گوناگونی درگیاهان از قبیل: شانکر (Canker)، بلایت (blight)، پژمردگی (Wilt)، خشکید‌گی سرشاخه (Dieback) و لکه‌برگی (Leaf spot)، پوسیدگی نرم (Soft rot) و تغییر رنگ اندام‌های گیاهی ایجاد می‌کنند.

آنزیم‌های تجزیه کنندة پکتات توسط باکتری‌های گروه carotovora و برخی گونه‌های متعلق به گروه amylovora از قبیل (Erwinia)Brenneriarubifaciens تولید می‌شود ( ) . تعدادی ازباکتری‌های گروه carotovora قادر به تولیدآنزیم سلولاز (celloase) هستند.

 

مواد و روش‌ها (روش تحقیق)

الف-نمونه برداری

در این تحقیق طی سال‌های1382-1380 از اوایل بهار با برنامه‌ریزی به طورهفتگی، حدود 10% از کل باغات گردوکاری استان (حدود800 هکتار) مورد بررسی و بازدید قرارگرفت.نحوة کار به این ترتیب بودکه مناطق عمدة گردوکاری شامل تویسرکان، همدان، ملایر، بهار و اسدآباد با تنوع تقریبی شرایط آب و هوایی، بیماری شانکر گردوموردردیابی و ارزیابی قرارگرفت.

نمونه‌های پوست تنه و شاخه‌ها به علاوة قسمت‌های سطحی چوب به تعداد لازم و کافی ازدرختان بیماردرطول فصول بهار، تابستان و اوایل پاییزبرداشته شد.نمونه‌های بیماری در داخل کیسه‌های نایلونی تمیز به آزمایشگاه منتقل می‌گردید، درضمن در هر مورد، مشخصات نمونه شامل:تاریخ نمونه برداری، محل، نوع آبیاری باغات و سایر مشخصات مهم ثبت می‌گردید.

ب- جداسازی

جهت جداسازی عامل بیماری، ابتدا نمونه‌های آلوده زیر جریان شیرآب معمولی به منظورحذف گردو غبار و عوامل ساپروفیت به طورکامل شسته شدند. سپس دوبار نیز جهت احتیاط با آب مقطر سترون شستشو و بعداً به درون ظروف پتری استریل که هم حجم آنها آب مقطرسترون اضافه می‌گردید، منتقل شدند.توسط اسکالپل استریل، نمونه‌ها درون آب مقطرخردگردیده و بعد از15-10 دقیقه، 2-1 لوپ، از سوسپانسیون حاصله بر روی محیط کشت‌هایEMB ,YDC که در شرایط استریل و  روز قبل تهیه گردیده بود، مخطط گردید.با نگهداری کشت‌ها به مدت 5-2 روز در دمای30-23 درجة سانتیگراد و  پس از رشدکامل، تک کلونی‌های سبز متالیک بر روی محیط EMB دوباره مخطط گردید.کلنی‌های سفید رنگ باکتری بر روی محیط NA نیز به روش تک کلون نمودن به محیط EMB  انتقال داده شد.

به منظور نگهداری ایزوله‌ها، تک کلونی‌های کامل و رشد یافته از محیط EMB به درون لوله‌های آزمایش حاوی محیط NA (نوترینت آگار) منتقل و به مدت 24 ساعت در درجه حرارت اُپتیمم (28-27 درجةسانتیگراد) نگهداری گردیدند . سپس با پارافین مایع استریل به ارتفاع حدود یک سانتیمتر از سطح محیط کشت، پوشانیده شدند.نمونه‌ها جهت انجام سایر مراحل تحقیق و استفاده‌های بعدی به درون یخچال (4 درجةسانتیگراد) منتقل شدند.

اثبات بیماری‌زایی:

جهت تلقیح باکتری، پنچ ایزوله انتخاب و پس از تعیین غلظت سوسپانسیون باکتری‌ها به 3%  و 4%، 5%  در OD مساوی با 600 نانومتر در ماه‌های خرداد و مرداد به شاخه‌های یکسالة درختان موجود در  باغ (درختان ایزوله و با فاصلة دور از سایر درختان) و همچنین تنة نهال‌های گردوی بذری دو ساله تزریق گردید.ضمنا ًجهت اثبات بیماری‌زایی در مرحلة دوم، با کاشت بذر چند ژنوتیپ مختلف گردو در خاک گلدان، و با رشد و مراقبت مداوم از آنها، در سن10-8  ماهگی نهال‌ها، با سوسپانسیون ایزوله‌های فوق و با غلظت ذکر شده تزریق گردیدند. سپس در شرایط آزمایشگاهی و مراقبت‌های لازم قرارگرفتند.

آزمونهای بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی:

- تعیین واکنش گرم باکتری‌ها به دو روش رنگ آمیزی گرم (gram staining) به روش Shaad (1988) و تست  KOH3 % به روش Suslow (1982) انجام شد.

-آزمون رشد هوازی و بی‌هوازی به روش Hugh & Leifson (1953)

-آزمون کاتالاز به روش Lelliot & Dickey (1984)

-آزمون اکسیداز به روش  Kovac (1956)

-آزمون اوره‌از به دو روش Shaad (1998) و Christensen (1946) و نتیجه تا 21 روز بر اساس تغییر رنگ محیط بررسی و ثبت گردید.

-آزمون تولیدگاز از گلوکز به روش Shaad (1998) و آزمون تولید مواد احیاءکننده از ساکاروز (RSS) به روش Dye (1969) انجام شد و با اضافه کردن معرف بند یکت (Benedict Reagent) بررسی گردید.

تحمل نمک طعام  به روش Sneath (1967) و فسفاتاز به روش Cowan Steel ( ) انجام گردید.سایرآزمون‌های مهم از قبیل، احیای نیترات  و غیره به روش شاد (Shaad,2001) صورت گرفت.

جدول شماره یک: سطح زیر کشت و میزان تولید گردو در استان همدان به تفکیک شهرستان در سال زراعی 81-1380

        مأخذ: مدیریت طرح و برنامه سازمان جهاد کشاورزی همدان

 

نتایج و بحث:    

1- نتایج آزمونهای بیماریزایی :

 الف- نتیجه مرحله اول :علائم بیماری پس ازحدود 14-12 روز در چهار ایزوله، بصورت متورم شدن پوست شاخه در محل تزریق و بدون تغییر رنگ بوده و پس از فشار دادن تورمها، شیرابة قهوه‌ای تیره رنگی ازآنها خارج می‌شد. اطراف محل تزریق بصورت کلروزه  بوده و در شرایط مساعد آب و هوایی (دما و رطوبت بالا)، علائم بیماری پیشرفت داشت.

 ب- نتیجه مرحله دوم : در یک ایزوله از پنج ایزولة تلقیح شده به درختان باغ، هیچگونه علائمی  بر روی شاخه‌ها و تنة  نهال‌ها بروز نگردید. از پنج مورد تزریق باکتری، در سه مورد، هیچگونه علائمی ظاهر نگردید. در دو مورد علائم پس از 20 روز به صورت کلروزه شدن (مقداری متمایل به قهوه‌ای) محل تزریق ظاهرگردیدکه احتمالاً می‌تواند از دلایل بروز واکنش فوق حساسیت در گیاه  باشد.

2-  خصوصیات باکتری عامل بیماری:       

باکتری‌ها، میله‌ای شکل، درانتهاکمی خمیده وگرد بوده و معمولا ًبصورت منفرد یا در زنجیره‌های کوتاه مشاهده می‌شوند. هر سلول باکتری متحرک و دارای پنج تاژک محیطی (پری تریکوس) می‌باشد که حدود 3-2  برابر طول باکتری هستند.قادر به تولید اندوسپور یا کپسول نبوده  و روی محیط کشت EMB به رنگ سبز متالیک و روی محیط YDC، پس از24 ساعت رشد، سفید وکروی می‌شوند.باکتری گرم منفی، اکسیداز منفی، کاتالاز مثبت و بی هوازی اختیاری (OFمثبت)، قادر به تولیدگاز سولفید هیدروژن از سیستین، اوره آزوفسفاتاز مثبت بودند.همة استرین‌ها قادر به تولید مواد احیاءکننده از سوکروز بوده ولی در تولید لوان متفاوت بودند.چنانچه  محیط کشتEMB دارای لاکتوز و فاقد سوکروز باشد، کلنی‌ها به رنگ صورتی پدیدار می‌شوند.

نتیجة آزمون تجزیة نشاسته در محیط حاوی 2%  نشاسته  و 5% عصارة مخمر بعد از12-10 روز مثبت بود، و نتیجه‌گیری می‌شود که باکتری مزبور توانایی تجزیة آهسته و ضعیف نشاسته را دارد.

بر اساس خصوصیات ذکرشده عامل بیماری شانکر باکتریایی در استان همدان             E.nigrifluens شناسایی گردید. در بررسی علائم مزرعه‌ای، از محل‌های نمونه برداری، دونوع شانکر مشاهده گردید که هر دو نوع در جنسErwinia (Brenneria) قرارگرفتند. با بررسی 128 باغ گردو، 21  ایزولة باکتریایی بدست آمدکه به عنوان Brenneria  nigrifluens  شناسایی گردید. حدود 20 درصد از باغات مورد بررسی و در هر باغ حداقل یک اصله درخت بیمار مشاهده گردید که با ایجاد زخم راه نفوذ سایر آفات  و عوامل بیماری‌زا را تسهیل کرده و بتدریج باعث زوال و مرگ و میر درختان می‌گردد.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

جدول 2- خصوصیات مرفولوژیکی، بیوشیمیایی و تغذیه‌ای استرین‌های E.nigrifluens عامل بیماری شانکر پوستی گردو

                                                    

2-علائم شناسی:

 در بررسی وبازدید باغات گردو، حدود20% از باغات وحداقل درهرباغ یک درخت گردو مشکوک به بیماری شانکر باکتریایی مشاهده گردید. علائم بیماری درمراحل اولیه بصورت ایجاد (دوحالت) نواحی نکروزه شده به رنگ قهوه‌ای روشن تا تیره (که در مراحل اولیه بصورت  نقاط متورم و بادکرده و همرنگ پوست بوده) در پوست تنه و انشعابات اصلی درخت میزبان که عمدتاً درتنة درختان مشاهده می‌شود.

در یک نوع از شانکرپوستی (شانکرسطحی یاShallow canker) نواحی نکروزه ابتدا بصورت نقاط کوچک کروی در ناحیه کورتکس و دقیقاً در زیرخارجی‌ترین لایه پوست (لایه چوب پنبه) که درشرایط مساعدآب وهوایی شامل وجود رطوبت کافی و هوای گرم، مشاهده گردیدکه در باغات  مورد بررسی با افزایش درجه حرارت و بارندگی یا آبیاری زیاد، شیوع بیماری افزایش وشدت آن هم بالا می‌رود.در مراحل اولیة بیماری به علت بوجودآمدن نواحی متورم درسطح پوست که اغلب همرنگ بافت سطحی پوست هستند بیماری مشهود نبوده ولی به مرور نقاط متورم که به حالت مجتمع بوده، پاره شده وشیرابة قهوه‌ای تیره تا سیاه رنگی به بیرون تراوش می‌کند که دربررسی‌های آزمایشگاهی هم از شیرابه هم ازبافت‌های پوست آلوده، باکتری بدست آمد.

شانکرگردو در مراحل  اولیه کم عمق بوده و تقریبا ًبه ضخامت 2/1 الی3/1 ضخامت پوست می‌رسد و در بعضی موارد باعث از بین رفتن آوند آبکش در محل حمله می‌گردد ولی غالباً درشانکر سطحی پوستی، نفوذ پاتوژن وخسارت آن محدود به بافت‌های پوست بوده ودرحدود10% مشاهده گردیدکه بافت‌های چوب را نیز با نفوذ عمقی آلوده می‌کندکه نتایج  بدست آمده  با یافته‌های تحقیقاتی ویلسون و همکاران (1957 ) و حریقی و رحیمیان (1997 ) و برادبری (1981) در مورد علائم شناسی بیماری مطابقت دارد.

در برخی موارد حالتی از شانکرگردو در باغات منطقه تویسرکان (خرمرود) و حومه همدان مشاهده گردید که با ایجاد شکاف در محل انشعابات شاخه‌های اصلی و نفوذ بیماری به قسمت‌های داخلی چوب گردو توأم بوده منتهی در بررسی‌های آزمایشگاهی هیچگونه باکتری بدست نیامد و دو ایزولة قارچی خالص سازی گردیدکه به نظر می‌رسد شانکر قارچی گردو (Melaxuma disease ) باشند. شانکر باکتریایی گردو بیشتر در محل تنه درختان و به مقدارکمتر روی شاخه‌های اصلی وجود داشت. به نظر می‌رسدکه بیماری در هر درخت روی مسن‌ترین قسمت آن یعنی تنه در درجة اول و در رتبة بعدی در شاخه‌های اصلی درختان فعالیت و ایجاد خسارت می‌کند. طبق بررسی‌های انجام شده نیز در آمریکا (کالیفرنیا) و مازندران بیماری عمدتا ًروی درختان مسن (20-10 ) ساله بیشترگزارش شده و حتی علائم بیماری نیز روی مسن‌ترین قسمت درخت یعنی تنه بوجود می‌آید و  در این بررسی علائم بیماری شانکر پوستی سطحی و شانکر پوستی عمقی روی درختان جوان یعنی 5-4 ساله نیز به وفور مشاهده گردید.  در ادامة بررسی روی درختان کهنسال گردو (حدود100 ساله) نیز علائم شانکرپوستی همراه با ترشح شیرابة قهوه‌ای تیره تا سیاه رنگ و به مقدار بسیار که باعث تیره رنگ شدن تنه درختان گردیده بود وجود داشت. بیماری در سال‌های اول باعث مرگ درختان نشده ولی به تدریج باعث زوال و مرگ و میر آنها با تنک کردن شاخ و برگ، ریزبرگی و کاهش کمیت و کیفیت محصول نسبت به درختان سالم می‌گردد و به نظر می‌رسدکه با ایجاد شکاف و زخم در پوست تنه و شاخه‌های اصلی راه نفوذآفات و عوامل بیماری‌زا را تسهیل کرده و بیشتر در معرض استرس‌های محیطی قرار می ‌گیرد.

                                                                                     

 

جدول شماره3: مناطق انتشار و میزان آلودگی باغات گردوکاری استان همدان به بیماری شانکر باکتریایی گردو

 

خصوصیات اکولوژیکی باکتری  E.nigrifluens      

با توجه به مشخصات اقلیمی نقاطی که بیماری شانکر پوستی گردو، برای اولین بار در دنیا از آنجا گزارش شده (ایالت کالیفرنیا)، نشان دهندة این مطلب است که درجه حرارت، نقش به سزایی درگسترش و محدودیت جغرافیایی این باکتری دارد. در منطقة ساکرامنتو (Sacramento) از ایالت کالیفرنیا، بیماری بیشتر در نواحی مرکزی این منطقه وجود داشته و گزارش شده که نسبت به بقیة مناطق گرمتر هستند.و ضمناً درصد شیوع این بیماری و اندازه لکه‌ها در مناطق سردتر، با مقدار و شدت کمتری گزارش شده است. درصد شیوع و شدت بالای بیماری غالباً از مناطقی است که میزان درجة روز (degree-day) این نواحی بالاتر از d.d  3000 بوده است.

طبق بررسی‌های انجام گرفته در ایتالیا، فرانسه و اسپانیا که این بیماری از آن نقاط گزارش شده، نقش افزایش دما برای ظهور و گسترش بیماری، تأییدشده است.

بررسی‌های انجام گرفته در داخل کشور (مازندران، فارس و کرمان) نیز تقریباً نتایج مشابهی بدست آورده اند. معمولا ًشروع فعالیت عامل بیماری با بالارفتن دما، مصادف است.

طبق مشاهدات انجام شده توسط نگارنده، فعالیت عامل بیماری در ماه‌های بیشتری از سال ادامه داشته و در سال‌های نسبتاً گرم تا اواخر مهرماه در استان همدان، باکتری مذبور از شانکرهای فعال شاخه و تنه قابل جداسازی بود (منتهی با غلظت پایین‌تر).در سال 1382 بیماری شانکر پوستی گردو، از اوایل خردادماه شروع به فعالیت نمود و تا اواخر مهرماه در تمام نقاط اصلی گردوکاری استان (تویسرکان، ملایر، همدان و اسدآباد) فعالیت داشت.با توجه به گرم شدن نسبی هوا در این سال، نشان دهنده و تاکیدی است بر تأثیر درجه حرارت در وقوع و شیوع این بیماری. باتوجه به اینکه دمای بهینه یا درجه حرارت اپتیمم برای رشد و فعالیت این باکتری 30-28 درجة سانتیگراد گزارش شده و در آزمایشگاه نیز در این محدودة دمایی، باکتری پاتوژن بیشترین فعالیت رشدی را داشته است. لذا به احتمال قوی پیش بینی می‌گرددکه در طبیعت هم دراین طیف دمائی، بیشترین فعالیت بیماری بروز کند.

مکان اصلی فعالیت باکتری عامل بیماری، دقیقاً در زیر ناحیة پوست درخت (غالباً در تنة درختان و کمتر در شاخه‌های اصلی) بوده و در فصل مساعد برای ظهور و پیشرفت بیماری (از اواخر خرداد تا پایان شهریور ماه) در ترشحات باکتری در محل شانکرها یا همان شیرابة قهوه‌ای تا سیاه رنگ آن، در آزمایشگاه، باکتری مذبور بدست آمد. به نظر می‌رسد که تا مدتی می‌تواند باکتری عامل در این شیرابه زنده بماند ولی طول مدت دقیق بقای باکتری در این حالت، بررسی نشده است.

شروع فعالیت بیماری هر ساله معمولاً از محل شانکر‌های سال قبل ظهور می‌کند، و بنابراین احتمال زیادی هست که باکتری در قسمت سطحی بافت چوب و زیر لایةپوست، زمستان‌گذرانی نماید.

با بررسی جوانه‌های درخت گردو در آزمایشگاه هیچگونه باکتری از این گونه بدست نیامد. یکی از مناطق احتمالی پایداری آن به غیر از مناطق زیر پوست درختان، باید خاک پای درخت باشد که نیاز به بررسی‌های بعدی و تکمیلی احساس می‌شود.طبق مشاهدات انجام شده درختانی که به هر نحوی در معرض استرس‌های محیطی نامناسب، از قبیل تنش آبیاری و یا تغذیة ناکافی قرار دارند، زودتر و بیشتر به این بیماری دچار می‌شوند.ضمنا ًدر چندین مورد مشاهده شده که درختانی که در تنه و شاخة خود، در اثر حملة پرندگان، حشرات، انسان یا عوامل مکانیکی دیگر دچار زخم و ترک خوردگی شده اند، دچار بیماری شانکر باکتریائی پوستی یا شانکر قارچی گردیده‌اند. به نظر می‌رسد که ایجاد زخم در بافت‌های پوست تنه و شاخه، یکی از راه‌های لازم و ضروری برای نفوذ باکتری باشد.

عامل بیماری شانکر پوستی گردو براساس برخی خصوصیات مرفولوژیکی، فیزیولوژیکی و بیوشیمیائی در جنس  Erwiniaو به دلیل عدم توانائی در تجزیة پکتات و حساسیت به  KCNدر گروه  Amyllovora قرار گرفته و به عنوان گونة  E.nigrifluensنامگذاری شده است .

دای در سال1968 بر اساس برخی خصوصیات فنوتیپی تفاوت‌‌های این گونه را با بقیة باکتری‌های گروه از قبیل E.tracheiphila، E.salicis، E.rubrifaciens و E.quercinaمشخص نمود ولی معتقد بود که تفاوت اساسی بین این گونه (E.nigrifluens) و E.amylovoraوجود ندارد و بدین دلیل آن را به عنوان واریته‌ای از E.amylovora طبقه بندی نمود. دای (1968) نشان داد که با وجود اینکه این باکتری و باکتری E.rubrifaciensبا وجود اینکه هر دو مسبب شانکر باکتریائی پوستی در گردو هستنند ولی وجه تشابه اساسی که بشود آنها را هم‌نام و مترادف یکدیگر قرار داد، وجود ندارد.

مطالعات بعدی ثابت کرد که این دو گونه حدود40% همولوژی DNA داشته و ضمناً میزان تشابه DNA این گروه (گروه آمیلوووا) با گروه Herbicola  حدود 19% می‌باشد در صورتیکه تشابه آن با گروه Carotovora حدود 45-35%  است.  بنابراین نتیجه‌گیری شده که تقسیم بندی قبلی دای (Dye, 1968) که گونة E.nigrifluens  را به عنوان واریته‌ای از گونة E.amylovora محسوب کرده بود یا طبقه بندی نموده بود، اشتباه است.

نتایج مشابهی توسط مطالعات برنر و همکاران حاصل شد. ضمناً نامبردگان نشان دادند که درصد تشابه این باکتری با E.carotovoraبیشتر از برخی اعضاء دیگر گروه Soft rot می باشد. بعلاوه نشان دادند که باکتری E.nigrifluens با بقیة اعضاءگروه Carotovora نیز درصد بالای همولوژی DNA  دارند.بررسی خصوصیات فنوتیپی و بر اساس آن انجام آنالیز عددی (Numerical  analysis) داده‌ها، باکتریE.nigrifluensرا به عنوان یک گونةکاملاً مجزا از بقیة گونه‌ها متمایز می‌سازد.کادو و آزاد (Kado & Azad,1980) با بررسی خصوصیات فنوتیپی دو استرین باکتری مزبور، 91-83% تشابه بین این دو استرین بدست آوردند.نامبردگان این گونه را در یک Subcluster مجزا ولی نزدیک به باکتری‌های E.rubrifaciens و E.quercina قرار دادند. در این بررسی گزارش نمودند که میزان همولوژی DNA در دو گونة E.nigrifluens و E.rubifaciens حدود 37% می‌باشد.

دای (Dye,1981) با استفاده از چهار روش آنالیز عددی نشان داد که گونة  E.nigrifluensیک گونة کاملاً متمایز نسبت به بقیة اعضاء گروه amylovora بوده و در گزارش قبلی خود (Dye,1968) که آن را واریته‌ای از E.amylovoraمحسوب کرده بود، تجدید نظر کرد.

نتایج آزمون‌های فنوتیپی انجام شده توسط نگارنده با مشخصات ذکر شده برای گونةE.nigrifluens  (Bradbury 1981 , Lelliott&Dickey 1984 , Verdonch et al.,1987, Wilson et al.,1957,Harighi&Rahiminan ,1997) مطابقت دارد.